中国动物保健品公司获两项疫苗专利授权

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中国动物保健品有限公司最近获得以下发明专利的授权:利用液相色谱检测系统定量口蹄疫抗原中146S含量的方法及口蹄疫纯化疫苗及其制备方法和应用。

口蹄疫(Foot-and-Mouth disease
virus,FMDV)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性的动物疫病,对畜牧业有着巨大的危害。目前大多数国家采取计划免疫为主的措施预防和控制口蹄疫,口蹄疫疫苗的质量是保证控制措施实施的重点,而抗原含量直接决定口蹄疫疫苗的质量和免疫效力。

I. 定量口蹄疫抗原中146S含量的方法

口蹄疫疫苗的生产需要按照GMP要求对工艺流程实行全程监控,包括病毒液收获、病毒液过滤、灭活、浓缩之后活病毒或灭活病毒含量的监测,对于口蹄疫抗原含量的检测分为生产过程中的检测及成品疫苗中抗原量的监督控制。鉴于我国目前的特殊情况,急需建立一种检测口蹄疫病毒灭活疫苗中病毒抗原含量的实验室检测方法,配合其它方法以提高口蹄疫疫苗质量监管力度,确保我国重大动物疫病强制性免疫防控措施的贯彻执行。

于二零一四年三月二十六日,本集团已自中华人民共和国知识产权局获得关于利用液相色谱检测系统定量口蹄疫抗原中146S含量的方法的授权。

1.ELISA方法

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease
virus,FMDV)引起的偶蹄动物烈性接触性传染病,主要危害牛、羊、猪、骆驼等偶蹄类动物,感染率高,传播速度快,是全球农业、社会、经济最具有危害性的传染病之一。虽然该病的死亡率不高,但可造成动物生产性能下降,且捕杀动物需花费大量的人力、物力和财力,还会影响国际肉类产品贸易,造成严重的经济损失和生物恐怖。

用纯化好的FMDV灭活抗原对Balb/c系小鼠进行三次免疫,首免采用颈背部皮下多点注射,使用弗氏完全佐剂乳化抗原;两周后采用腹腔注射进行第二次免疫,使用弗氏不完全佐剂乳化抗原;两周后采用尾静脉注射再进行加强免疫;3天后进行融合。采用经典的融合方法进行杂交瘤细胞的融合与筛选操作,使用间接夹心ELISA方法对分泌抗口蹄疫146S抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞进行检测。采用有限稀释法对筛选出来的阳性杂交瘤细胞进行克隆化,并进行扩大培养及大量冻存,使用腹水法大量生产单抗。使用间接ELISA法测定腹水型单克隆抗体及细胞培养上清液的效价,对各株单抗的腹水样品进行免疫琼脂扩散试验来确定单抗的类型。通过West-blotting试验确定抗体构型。确定抗原含量与抗体滴度之间的线性关系。

FMD病毒是高度变异的小RNA病毒,有7个血清型(A、O、C、Asia 1、Sat 1、Sat
2及Sat
3)和大量的亚型、拓朴型。世界动物卫生组织呼吁全球控制和消灭口蹄疫。疫苗接种是特异性预防FMD的有效手段,安全有效的疫苗是成功地预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。FMD疫苗具应有良好的免疫原性,不仅防止动物疾病发生,且有效预防感染和阻断自然传播链,也应安全、易于制备、分发、运输,对各种型、亚型FMD病毒的感染提供终生免疫。在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用。灭活口蹄疫疫苗的免疫效果主要取决于口蹄疫病毒颗粒146S完整性,疫苗中活性组分146S检测定量的方法是蔗糖密度梯度法,这种方法已经使用30多年,操作多为人工步骤多变难于控制、自动化程度低。

简单来说该方法就是制备口蹄疫病毒单克隆抗体,建立血清学方法测定疫苗中总抗原含量。该方法优点是成本低,利于推广使用,可以批量进行样品抗原含量的比较,操作简单快速,结果特异,缺点是单克隆抗体制备过程复杂,且只能检测部分抗原位点,若抗原位点组成有变化,使用该检测方法可能有误差。

CAH研发了QM146S并获得专利。此专利基于高压液相层析分离疫苗抗原146S,通过254nm的光吸收检测其含量。该方法的检测限度
5-60μg/mL,适合不同的口蹄疫病毒株,和传统推荐方法有良好的相关性。发明的方法使用标准层析介质易于品质控制和自动化,可作为口蹄疫疫苗制造厂家、国际口蹄疫疫苗库、药品监管部门对口蹄疫疫苗成品品质控制检测方法,也可作为口蹄疫疫苗生产程式控制的分析方法。

2.蔗糖密度梯度法

II. 口蹄疫纯化疫苗专利

在口蹄疫疫苗的生产过程中,146S病毒粒子作为口蹄疫病毒的主要免疫原,其任何形式的降解都会导致疫苗免疫效力的下降。传统的监测方法中首先通过补体结合试验估测总抗原含量(包括146S和12S),然后用氟化碳处理除去12S抗原,间接估测出主要免疫原146S的CF量;或者超速离心获得146S抗原,直接估测146S的CF量。一些生产厂家通过蔗糖密度梯度离心法获得一定体积口蹄疫病毒146S病毒粒子,使用紫外分光光度计在259nm紫外光下检测吸收峰,从而测定其含量。采用这种方法可以快速测定出在紫外分光光度计图表中病毒峰区域的146S病毒粒子含量,并且可以用于生产过程中病毒和抗原收获量的监测,也可用于成品苗中口蹄疫病毒146S抗原含量的测定。测定口蹄疫病毒146S抗原量也可通过氯化铯密度梯度离心法进行定量分析,在ug/ml水平估测146S抗原量,并用PAGE凝胶电泳检测口蹄疫病毒抗原多肽的完整性,并确定其质量。

于二零一四年四月三日,本集团已自中国知识产权局获得关于口蹄疫纯化疫苗专利的授权。

3.组织细胞培养法

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease
virus,FMDV)引起的偶蹄动物烈性接触性传染病,对发病国家经济产生重大影响。疫苗免疫是控制口蹄疫的重要方法。FMDV不同血清型或亚型出现,对疫苗研发者来讲,面临疫苗株适宜快速筛选、缩短新型病毒疫苗研发时间、改进和验证生产工艺提高产能,促成早期免疫,提高疫苗免疫保护期、并能区别感染和免疫的动物、保证大规模免疫的问题。疫苗的品质改进可有效控制口蹄疫爆发、最大限度减少疫苗免疫副反应或动物免疫后出现的问题,因此口蹄疫疫苗应使用高度安全无其他杂质的纯化口抗原,能够对牛、猪、羊等所有易感动物产生超级免疫、高效保护,但不引起病毒持续感染。因此有必要改善现有疫苗的品质,提高安全性、有效性和稳定性。

组织细胞培养法主要使用实验重复性较好的BHK21传代细胞系来进行,通过在显微镜下观察不同稀释度的
FMD病毒感染 BHK21细胞时所产生的
CPE来判定实验结果,该实验耗时较长,人为因素影响较大。

CAH通过疫苗工艺和质控方法不断改进,创制了口蹄疫纯化疫苗。用该专利技术制备的纯化疫苗有效抗原146S颗粒在4℃贮存的稳定时间与传统浓缩苗类似,在纯化原液制品中无蛋白裂解现象,而传统浓缩原液制品中有裂解现象发生。

4.病毒蚀斑数测定法

所有纯化疫苗经检验无细菌、无真菌污染,在乳鼠、牛上没引起任何副反应,表明纯化疫苗无菌且安全。用此专利技术制备的纯化疫苗在4℃贮存长达
16周效价不降。对牛、猪诱导高水准的中和抗体,且在牛免疫后250天也可测到中和抗体,给猪、牛等易感动物提供了高效免疫。相反传统浓缩口蹄疫疫苗诱导的O型FMD、A型FMD、亚1型FMD抗体水准低,抗体持续时间短。应用浓缩、纯化专利技术研制纯化口蹄疫疫苗,配制和贮存简单方便,疫苗高效、安全、稳定,品质保证。

目前,国外一些实验室和疫苗公司采用病毒蚀斑数测定法。使用BHK21细胞或IB-RS-2细胞,按常规方法来培养细胞,用无菌
PBS冲洗细胞,病毒作梯度稀释,接种细胞培养板,在CO2培养箱里培养
1小时后,加入一定量的培养液,静置培养48小时,弃去培养液,加固定液固定,染色30分钟,蒸馏水冲洗,自然干燥后进行判定。FMD病毒感染细胞时,先感染离它最近的细胞,最终形成了一个个肉眼可见的病毒感染斑,对感染斑记数,按特定的公式来计算病毒的滴度。该法操作方便,判定方法简单快捷,测定结果也很准确,值得借鉴。缺点是没有涉及到抗原性的变化。

中国动物保健品有限公司主要从事兽药制造、销售及分销业务。本集团是国内兽药行业的翘楚,拥有粉剂、针剂和生物药共14个专利产品品牌。集团旗下超过500种治疗和非药物治疗的家禽和牲畜兽药在全中国直接分销到32间大型家禽公司、26个省、自治区和直辖市的兽医站、以及约
4,900间兽药零售商的庞大网络,而该等零售商会转售兽药予农民。我们生物药的产品范围包括猪瘟、猪繁殖与呼吸综合症和动物口蹄疫的疫苗,而按照中国农业部的规定,此等疫苗属强制性。

5.乳鼠接毒法

病毒梯度稀释后接种乳鼠,一定日期内统计小鼠死亡数量,计算病毒的LD50。该方法缺点是用时较长,通常为3~4天,不利于疫苗生产企业的集约高效生产。另外,动物水平的实验由于样本数量的限制,误差较大。

6.荧光定量PCR

实时荧光定量RT-PCR(Realtime Fluorescent Quantitative
PCR)技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。该技术以特异性强、速度快、灵敏度高等优点,在基因表达水平分析、病原体基因的定性和定量检测等方面得到广泛应用,并且已经成为当前病毒核酸快速检测的主要方法。利用口蹄疫146S抗原定量技术抗原含量关系的标准抗原作为对照,通过对口蹄疫病毒的RNA进行检测,并进行待检样品与标准抗原曲线的对比,实现由病毒RNA荧光Ct值的测定向抗原含量的转变(Ct值指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系)。该方法操作用时短,节约生产成本。缺点是检测过程可能出现反应的不稳定性,造成误差。

7.蛋白层析法

胶体金免疫层析技术是20世纪80年代在胶体金标记技术、免疫层析技术基础上建立的一种独特的免疫学检测技术。它以胶体金作为示踪物,利用特异性抗原抗体结合原理,通过胶体金颗粒的颜色放大免疫反应系统,使反应结果在固相载体上直接显示出来。

FMDV感染动物后可造成隐性感染,并在易感动物之间进行传播。制定区分感染动物与免疫动物的有效检疫是控制其流行的根本措施。FMDV的一种
NSP抗原仅与感染动物的血清产生反应,随着对FMDV
NSP研究的进一步深入,研究者认为针对非结构蛋白3ABC抗体的检测是一种理想的检测方法。在这些研究的基础上,可利用大肠杆菌高效表达的FMDV
3ABC多肽作为包被抗原,建立可区分感染动物与免疫动物的试纸条技术。

胶体金试纸条具有操作简单,检测速度快等优点,但是该方法的
结果判定是通过观察检测显色条带的有无,因此大多数胶体金免疫
层析试纸条只能用于定性和半定量的检测。

8.分子排组色谱法

2011年Marcelo等建立了一种新的方法来定量口蹄疫病毒完整粒子。是在疫苗生产过程中通过分子排阻色谱来分离病毒培养液中的不同组分,将146S分离出来,通过波长254nm下的光吸收值来测定146S含量。检测范围为
5~70ug/mL,该方法适用于不同的口蹄疫病毒株,与蔗糖密度梯度离心法有良好的相关性。这种方法使用标准的层析介质,可以实现自动化操作。这种方法如果能开发成一种成熟的检测试剂盒,极有可能成为口蹄疫疫苗生产过程中的一种新检测工艺,用于监控最终产品的质量。但与其他方法相比,该方法最低检测限高,灵敏度低,不适宜用于146S含量较少的样品,不能区分检测到的146S是否被蛋白酶水解。该方法自动化程度高,操作相对简单,但检测灵敏度目前不高,有待进一步的提高。

9.其他

用于抗原定量的其它方法有放射免疫试验、反向被动血凝试验及固相红细胞凝集试验。这些试验的敏感性也较高,特别是反向被动血凝试验和夹心ELSIA
具有同样的敏感性。用这些方法所进行抗原定量和疫苗的免疫保护的关系尚需进一步研究。

总之,用以上讨论的方法检测疫苗都有报道。但到现在为止国际上还没有一种统用的、标准的方法来检测疫苗的抗原含量。这就一方面需要实验室间的合作,另一方面对这些方法需要进一步研究。总体而言,目前我国口蹄疫灭活疫苗的质量监控系统比较完善,相对于各种疫苗的质量检测技术和手段正在不断的提高,向着更加标准化、精确化和便捷化的方向发展。兽药监察及检验机构对口蹄疫疫苗抗原含量的检测技术的研究也在不断的完善和创新,以确保安全有效的疫苗用于口蹄疫疫病的防控,为我国畜牧业的健康发展提供坚实的保障。

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